化学工业与工程  2019, Vol. 36 Issue (1): 64-71
Accumulibacter各进化枝选择性富集及其生态位
李柱1,2 , 王少坡1,2 , 赵乐丹1,2 , 邱春生1,2 , 郑剑锋1,2 , 于静洁1,2 , 赵明3 , 孙力平1,2     
1. 天津城建大学环境与市政工程学院, 天津 300384;
2. 天津市水质科学与技术重点实验室, 天津 300384;
3. 天津三博水科技有限公司, 天津 300384
摘要:废水强化生物除磷(EBPR)系统中,聚磷菌(PAOs)是主要的除磷微生物,其中Accumulibacter是目前公认的主要一类PAOs,含有多个进化枝,且代谢特性存在差异。虽然PAOs尚无法独立培养,但可以在某些条件下选择性富集某一类进化枝的Accumulibacter。对废水EBPR系统内检测到的Accumulibacter具体分枝及其富集的条件进行了总结,并归纳了不同分枝的代谢特性;还分析了Accumulibacter主要分枝与其它菌群在EBPR系统中的相互关系,可为深入了解废水生物除磷微生理生态学、解决同步脱氮除磷污水处理系统的除磷性能恶化、出水水质波动等问题提供支持。
关键词强化生物除磷    Accumulibacter    进化枝    选择性富集    生态位    
Selective Enrichment and its Ecological Niche of Accumulibacter Clades
Li Zhu1,2 , Wang Shaopo1,2 , Zhao Ledan1,2 , Qiu Chunsheng1,2 , Zheng Jianfeng1,2 , Yu Jingjie1,2 , Zhao Ming3 , Sun Liping1,2     
1. School of the Environment, Tianjin Chengjian University, Tianjin 300384, China;
2. Tianjin Key Laboratory of Aquatic Science and Technology, Tianjin 300384, China;
3. Tianjin Sambo Water Technology Co. Ltd., Tianjin 300384, China
Abstract: Phosphorus accumulating organisms (PAOs) are the group of microorganisms primarily responsible for removing phosphorus from wastewater in the Enhanced Biological Phosphorus Removal (EBPR) system. Accumulibacter is currently recognized as the main class of PAOs, which contains several clades. Their metabolic characteristics are different. Although PAOs can not be cultured independently, some kind of clades can be selectively enriched under certain conditions. This paper summarized the specific clades and enrichment conditions of Accumulibacter in the EBPR system, and the metabolic characteristics of different clades were analyzed. The relationship between the main clade of Accumulibacter and other microorganisms in the EBPR system was also analyzed in order to provide reference for deeply understanding of biological phosphorus removal microphysiological ecology, as well as solving the problem of deterioration of phosphorus removal or effluent fluctuation in the simultaneous nitrogen and phosphorus removal wastewater treatment systems.
Keywords: enhanced biological phosphorus removal    Accumulibacter    clade    selective enrichment    ecological niche    

强化生物除磷工艺(Enhanced Biological Phosphorus Removal, EBPR)已经广泛用于污水除磷(P),以防止受纳水体富营养化。目前针对广泛存在于EBPR系统中的聚磷微生物(phosphorus accumulating organisms,PAOs)已经开展了大量研究。厌氧条件下,PAOs利用胞内多聚磷酸盐(Poly-P)和糖原水解产生的能量吸收碳源,并以聚β-羟基脂肪酸(PHA)形式储存碳源。好氧条件下,PAOs能够利用氧化PHA获得的能量来积累过量的磷进入细胞[1-3]。PAOs的类型有很多种,β-变形菌纲下的一类聚磷菌被命名为“Candidatus Accumulibacter phosphatis”,一般简称为Accumulibacter。Accumulibacter的多样性通常以ppk1基因系统发育的功能来描述[4-5]

聚合磷酸盐激酶(PPK1)是PAOs细胞内催化合成Poly-P的关键酶,而ppk1是编码合成这种酶的功能基因,ppk1的表达过程直接影响PAOs的代谢活性和吸磷效果。根据聚磷酸盐激酶基因(ppk1),Accumulibacter被分为2大类型(I型和II型),每类包含几个不同的分枝[4, 6]。I型有5个分枝(IA-IE),II型有9个分枝(IIA-IIH、II-I),共有14个分枝[4, 7]。Accumulibacter是在生产规模的EBPR系统中发现的,在实验室规模的反应器中很容易富集[8-9]。不同的运行条件,如温度、碳源等,可能会导致不同PAOs进化枝富集能力的差异[10]

至今未能成功分离PAOs[11],而且特定Accumulibacter分枝选择性培养所需要的条件尚不清楚[12-13],仍需对不同进化枝的富集培养及代谢特性作进一步研究。有学者指出环境条件决定了Accumulibacter的种群结构[6]。不同运行条件下EBPR系统中Accumulibacter的进化枝类型不同,各进化枝又具有不同的代谢特性和生理特征[14]。最近的研究表明,PAO I和II在形态方面、化学计量数、动力学速率、反硝化能力以及对环境压力的忍耐力方面具有不同的特性[8, 15-17],这些差异可能会导致在一定条件下某些特定分枝的富集,进而可能影响生物除磷工艺性能。基因组比较分析表明,Accumulibacter进化枝在氮代谢和碳固定方面具有不同的能力,这有助于选择性地富集不同的Accumulibacter种群[18]。研究表明,反硝化能力可能与特定的Accumulibacter分枝或菌株有关[8-9, 15],不同的Accumulibacter进化枝对不同电子受体的利用能力有显著差异[8],从而可能产生不同的反硝化结果,进而影响反硝化除磷效果[14]。有大量的研究证明在不同的生物除磷系统中,微生物的结构组成有明显的不同。除磷系统生物群落结构随着电子受体的变化而改变,聚磷菌种类具有多样性。在对除磷微生物菌落结构、功能等方面了解有限的条件下,解释试验中相关化学变化产生的原因是很困难的。此外,不同PAO进化枝的代谢特性有所不同,阐明不同PAO分枝的代谢能力,有助于更好地理解微生物的生态位及优化生物除磷过程中微生物生态和性能之间的关系,进而有助于对生物除磷系统进行更好的控制,实现稳定的除磷性能。

1 Accumulibacter各进化枝的选择性富集 1.1 碳源

污水处理过程中不同类型碳源可能产生不同功能的微生物群落,进而影响EBPR的性能。乙酸(HAc)和丙酸(HPr)是EBPR常用的碳源,其它类型碳源如葡萄糖、乙醇等,在EBPR系统中可能会富集不同的Accumulibacter进化枝。现有EBPR机理的研究大多数是以人工合成废水为基质展开的,而采用多种挥发性脂肪酸(VFA)的混合基质甚至是实际废水来研究EBPR机理更有应用价值[19]

Saad等[20]在pH=7.6,高进水P/COD[n(P):n(C)],以m(HAc):m(HPr) 3:1作为混合碳源的条件下,PAO IC成功地富集至99%,而没有观察到PAO II或聚糖菌(GAO)。而Camejo等[21]在厌氧-微好氧模式下以乙酸为碳源,成功富集PAO IC(占Accumulibacter的99%)。Slater等提出具体的PAO分枝在乙酸-EBPR系统中表现出不同的效果,PAO IIC除磷性能差,而PAO分枝I除磷性能良好[16, 22]。吉茸等[23]分别以乙酸和丙酸为碳源运行2个序批式反应器(SBR),结果发现乙酸系统以PAO II为主导,占全菌63.7%;丙酸系统以PAO I为主导,占59.91%。Gonzalez-Gil和Holliger表明丙酸有利于PAO IIA型占优势,更重要的是,该类型的Accumulibacter可能决定了除磷的鲁棒性[24]。目前来看,乙酸系统既可富集PAO I,也可富集PAO II,而丙酸有利于富集PAO I。同样的碳源富集到不同的分枝,说明除了碳源之外,可能还有其它因素的作用。

实际污水处理厂污水组成和运行情况比较复杂,会导致污水中Accumulibacter种类比较丰富,研究表明实际污水除磷系统中的Accumulibacter主要以II型为主[20]。为了提高EBPR性能,在污水处理厂中添加外部碳源是很常见的,乙醇作为外部碳源来强化生物除磷似乎是可行的[24]。乙醇可以对具体的PAO种群进行选择,如Accumulibacter分枝IIF基因组含有可处理乙醇的乙醛脱氢酶[38]。因此,可以将乙醇应用于EBPR中以选择性地富集特定的PAO种群,如PAO IIF。

1.2 温度

普遍认为,温度对EBPR系统有很大影响。温度会影响微生物体内物质的运输以及酶的活性,进而影响EBPR系统的稳定运行。

研究表明,较高运行温度使反硝化除磷污泥中的菌群更具有多样性。Acevedo等[25]在研究聚磷菌的代谢迁移时,发现温度为20 ℃下运行SBR反应器,PAO I占(23±5%),PAO II占(36±7%)。研究表明PAO可以在较高的温度(30~35 ℃)下有效作用。Ying等[26]在研究温度对聚磷菌和聚糖菌竞争的影响时发现在高温(32 ℃)时,PAO占19%,GAO占40%,除磷效果却并没有恶化,PCR分析表明该温度下污泥中的聚磷菌只有PAO IIF。目前关于Accumulibacter在低温条件下富集培养和特性的报道较少。Camejo等[21]研究中试规模SBR反应器在厌氧-微好氧模式下运行,温度为11~26 ℃,不同试验段PAO IIC相对丰度从19%升至67%。而Tian等[27]研究了低温(10 ℃)下的Accumulibacter分枝I,表明低温是富集该菌种的一个关键因素。10 ℃下,长期运行SBR反应器,观察到分枝I逐渐向分枝II转移。在EBPR群落中无论PAO分枝I或II占优势,除磷性能并没有受到影响[22]。Zou等[10]在低温下(8~11 ℃)富集PAO,其占总菌的79.3%。

总之,较高的温度有利于GAO占优势,但高温条件下也会有PAO的存在(如PAO IIF);低温可以对PAO的分枝进行选择,但低温下系统主导菌群发生变化的原因需结合环境条件综合考虑。

1.3 污泥龄

不同污泥龄(SRT)可以富集不同类型的Accumulibacter[10, 22]。较短的SRT似乎更有利于EBPR的稳定,但较长的SRT可以缓解外界对微生物的选择压。然而,在以前的报道中,SRT与除磷性能以及相关菌群之间的关系尚未得到充分的研究。Tian等[27]的研究发现,SRT为16 d时培养的PAO I作为主要的PAO分枝,而SRT为32 d时培养得出PAO II为主导菌群,这表明较长的SRT为Accumulibacter分枝IIA(相比分枝I)提供竞争优势。而Annalisa等[28]认为SRT与分枝IA或IIA丰度之间无明显相关性。EBPR系统内不同SRT下富集的微生物如表 1所示。

表 1 不同SRT下富集的微生物 Table 1 Microorganisms enriched under different SRT
文献 SRT/d HRT/h pH值 DO/(mg·L-1) 微生物
Camejo[21] 80 24 7.0~7.5 0.2 PAO IC
80 24 7.0~8.0 0.2~0.7.0 PAO IIC
Saad [20] 8 12 7.6±0.5 1.8 PAO IC
Acevedo[25] 8 PAOI(66±7%)
PAOII(8±3%)
Annalisa[28] 6 12 7.0~7.3 4.0~5.0 PAO(17.5%)
7 7.0~7.3 4.0~5.0 PAO(15.3%)
10 7.0~7.3 4.0~5.0 PAO(10.5%)
20 7.0~7.3 4.0~5.0 PAO(7.1%)
40 7.0~7.3 4.0~5.0 PAO(3.2%)
Tian[27] 16 7.0±0.1 PAO I
注:HRT为水力停留时间;DO为溶解氧。
1.4 进水n(P)/n(C)

磷浓度是影响主导Accumulibacter类型和种群大小的重要因素,不同进水磷浓度,对PAO各分枝的富集会产生一定影响,这可以从PAO分枝代谢方式来解释。研究表明,进水总磷(TP)、化学需氧量(COD)和总氮(TN)浓度与进化枝IID的相对丰度呈正相关,而所有这些与进化枝IIC呈负相关,意味着两个进化枝之间存在功能差异[7]。进水磷浓度的增加导致厌氧末释磷量较高和正磷酸盐浓度较高。P限制条件下,Accumulibacter分枝II能够调整其代谢方式在低n(P)/n(C)(磷碳比,C指含碳有机物,下同)下增殖,而分枝I不能[29]。当进水n(P)/n(C)减小,进而导致微生物胞内聚磷含量也减少时,可以观察到PAOs的代谢方式由聚磷代谢向聚糖代谢转变,而PAOs菌群由Acc. I为主导转变为Acc. I和Acc. II混合主导[25]

此外,II型对磷酸盐的亲和力高于I型。在磷酸盐浓度小于5 mg/L的情况下,IIA-B型占主导,而在50和500 mg/L时IA型占优势。某些PAO分枝的动力学速率随着生物P物质的量浓度的增加而增加,n(P释放)/n(HAc摄取)在0.03~0.61之间波动,取决于进水磷浓度。不同n(P)/n(C)下化学计量数和动力学参数的比较见表 2

表 2 不同n(P)/n(C)下化学计量数和动力学参数的比较 Table 2 Comparison of stoichiometry and kinetic parameters under different n(P)/n(C)
文献 SRT/
d
HRT/
h
进水n(P)/
n(C)
微生物 C(Ca2+)/
(mg·L-1)
n(P)/
n(HAc)
n(Gly)/
n(HAc)
n(PHV)/
n(HAc)
n(PHB)/
n(HAc)
n(PHV)/
n(PHB)
Welles et al[31] 8 12 0.0056 PAO II和GAO 3.8 0.03 1.28 0.54 1.45 0.37
8 12 0.1250 PAO 10 0.70 0.38 0.05 1.31 0.04
Acevedo et al[25] 8 12 0.1250 PAO 10 0.08 1.08 0.28 1.74 0.16
8 12 0.0380 PAOII(99±6%) 3.8 0.22 0.96 0.23 1.24 0.19
32 12 0.0510 PAOI(38±26%) 3.8 0.37 1.11 0.29 1.36 0.21
Welles et al[17] PAOII(61±28%)
8 12 0.0660 PAOI(98±9%) 3.8 NA NA NA NA 0.36
NA NA 0 PAO IIC 3.8 0.01 1.01 0.32 1.22 0.27
8 12 0.0380 PAO IIC 3.8 0.19 1.22 0.26 1.37 0.19
8 12 0.0380 PAO IIC 3.8 0.31 0.86 0.19 1.17 0.16
Welles et al[29] 8 12 0.0510 PAO IIC 3.8 0.33 1.02 0.16 1.07 0.15
8 12 0.0770 PAO IIC 3.8 0.50 0.89 0.14 1.00 0.14
8 12 0.1100 PAO IIC 3.8 0.61 0.66 0.12 0.97 0.12
注:PHB:聚-β-羟基丁酸;PHV:聚-β-羟基戊酸;Gly:糖原。
2 Accumulibacter各进化枝的反硝化特性 2.1 Accumulibacter各进化枝的代谢差异

污水处理厂中Accumulibacter各进化枝的分布与EBPR性能之间存在一定关系[20],由于缺乏特定PAO分枝的高度富集培养,有关PAO反硝化能力的报道仍存在矛盾。参与磷代谢的基因的多样性为EBPR过程提供一种选择压。投加不同的电子受体,EBPR系统内的微生物群落结构就会产生显著性差异。之前的研究报道PAO具有使用1个以上电子受体进行吸磷的能力[33-34],但不同PAO分枝利用电子受体的情况不尽相同[21]。研究PAO各进化枝以不同电子受体进行吸磷的能力以及它们的代谢差异,对于了解PAO种群的多样性有重要作用。

学者对于不同PAO分枝使用电子受体的能力仍存在争议。Lanham等[35]发现分枝IA可以利用NO3-和O2为电子受体进行吸磷;Pan等[36]认为分枝IA代表一种DPAOs,能够利用NO3-作为最终电子受体进行吸磷,在NO3-和O2同时存在时,其它好氧PAOs仅利用O2为电子受体进行吸磷,即好氧吸磷是DPAOs和其它菌群作用的结果。反硝化除磷系统的性能差异可能与Accumulibacter分枝结构以及是否存在参与反硝化途径的酶相关[21]。Flowers等发现反硝化吸磷时,IA、IIA分别以硝酸盐、亚硝酸盐作电子受体[8, 31]。宏基因组学研究结果表明,分枝IIA不具备硝酸盐还原酶,但是具有亚硝酸还原酶,解释了其不能还原硝酸盐但可以还原亚硝酸盐的原因[37]。Kim等[9]用FISH-MAR证明,进化枝IA、IIA、IIC和IIF不能利用硝酸盐。宏基因组研究显示,只有PAO进化枝IIF能编码硝酸盐还原酶和亚硝酸还原酶基因,而其他进化枝(IA,IB,IC,IIA,IIF)只编码胞质硝酸盐还原酶的基因。这种还原酶在反硝化中的作用尚不清楚[20, 38]

Camejo等[21]在厌氧-微好氧条件下运行218 d时,PAO IID占Accumulibacter的96%,推测它也能够在微氧条件下使用多个电子受体,但这一结论仍需试验加以验证。有报道称IIC可以利用硝酸盐为电子受体进行缺氧吸磷[9],Camejo等在中试反应器富集的进化枝IIC对氧作为电子受体表现高度的亲和力[21]。Welles等[29]在研究不同进水n(P):n(C)比对PAO IIC的代谢响应中,发现微生物在不同磷酸盐水平下能够采用不同的代谢行为进行增殖。研究发现,Accumulibacter进化枝IIC的4个基因组携带启动原核反硝化途径的呼吸性硝酸盐还原酶基因[18]。基因组差异可能促进SBR中Accumulibacter分枝的转移,所以需要进一步研究PAO胞内有关代谢的酶的基因,进而区分具体分枝代谢的差异。

2.2 PAO IC反硝化硝酸盐的能力及与其它菌群的关系

目前有关PAO I利用硝酸盐作为电子受体能力的报道仍存在争议,特别是关于PAO分枝水平上亚硝酸盐还原的研究还很少[39],可能存在的问题是反硝化过程中PAO是否与其他微生物种群存在协作关系。

早期的研究表明,PAO可以以硝酸盐或亚硝酸盐为电子受体进行缺氧吸磷,可以减少碳源和污泥产量;后来的研究表明,使用硝酸盐或亚硝酸盐进行反硝化的能力根据PAO分枝类型不同而有所不同[40]。Saad等[20]的研究认为富集的PAO IC不能通过NO3-反硝化;或者它们具有不适用于NO3-还原的呼吸链。Flowers等表明PAO I能够利用硝酸盐作为电子受体[8, 40]。Camejo等[21]在厌氧-微好氧条件下富集了PAO IC(占Accumulibacter大于99%),该进化枝能够同时使用氧气、硝酸盐和亚硝酸盐作为电子受体吸磷,但比起硝酸盐和氧气,亚硝酸盐使用效率较低,作者认为PAO IC的基因编码了一套完整的反硝化途径的酶,包括胞内硝酸盐还原酶(nap)、亚硝酸盐还原酶(nir)和一氧化氮还原酶(nor)。这一矛盾说明基于ppk1基因定义Accumulibacter进化枝不能明确地区分其代谢特性,从而导致PAO IC更具有多样性,其中包括可以反硝化的微生物和不能反硝化的微生物。但除此之外,还可以解释为存在除聚磷菌之外的其它微生物参与反硝化过程,即边缘种群负责从硝酸盐到亚硝酸盐的部分反硝化。PAO特异性吸磷活性可能依赖于另一组细菌产生的NO2-[20]。Rubio等[40]通过研究PAO I和PAO I-GAO混合种群,发现富含PAO I的种群不具有以硝酸盐作为电子受体进行缺氧吸磷的能力,而反硝化GAO通过将可用的硝酸盐反硝化为亚硝酸盐,被PAO进一步利用进行反硝化吸磷。而在EBPR系统中,聚糖菌(GAO)被认为是PAO的竞争者,因为它们在厌氧条件下竞争VFA,但不过多吸收超过其生长需求的磷。这意味着生态位重叠的2个微生物种群会发生竞争。综上所述,反硝化GAO不仅在厌氧阶段与PAO竞争底物,也在缺氧环境中为PAO提供电子受体(亚硝酸盐),即与PAO既是竞争又是协作的关系。

2.3 NO2-对PAO分枝、AOB、NOB的影响

脱氮过程中,好氧段氨氧化细菌(AOB)氧化NH4+为NO2-,亚硝酸盐氧化细菌(NOB)氧化NO2-为NO3-。部分亚硝化(PN)和厌氧氨氧化(ANAMMOX)的结合是一种很有前途的废水脱氮方法。在PN反应器中,好氧氨氧化菌(AOB)将废水中的部分氨氮氧化成亚硝酸盐,而其余的是在厌氧条件下以亚硝酸盐为电子受体,通过厌氧氨氧化工艺氧化为氮气[41]。如果能将反硝化除磷与亚硝化结合起来,即聚磷菌使用来自亚硝化作用产生的NO2-作为吸磷过程的电子受体,则聚磷菌、AOB、Anammox菌一起协同处理污水,可以达到同步脱氮除磷的效果。因此,研究NO2-存在条件下,PAO的菌群结构以及PAO还原NO2-的能力对于通过亚硝酸盐途径实现反硝化除磷至关重要。EBPR工艺与短程硝化过程的结合可能有利于碳源、能源的高效利用以及工艺的稳定。以亚硝酸盐作为电子受体反硝化除磷可以:1)降低碳源消耗量;2)降低污水处理厂的需氧量;3)生长量低,有助于降低污泥产量[40]

曾薇等[41]采用MUCT工艺处理实际生活污水,发现Acc-IID的丰度与NO2--N浓度变化趋势一致,所以Acc-IID以NO2-为电子受体进行反硝化除磷,且Acc-IID始终是优势聚磷菌,达到总Accumulibacter的92%。曾薇等[39]发现分枝IID对于亚硝酸盐有很强的忍耐力,在亚硝酸盐高浓度累积条件下,主要由IID进行反硝化除磷;而分枝IIC在低亚硝酸盐积累条件下为主导分枝。AOB、NOB和PAO进化枝通过亚硝酸盐积累的变化相互作用,AOB丰度较高以及抑制NOB均有利于进化枝IID反硝化除磷[37]。此外,反硝化的最终产物可以是N2或N2O[20, 42]。与PAO I相比,N2O对PAO II的毒性更大,导致PAO II不能利用硝酸盐进行反硝化,但需要进一步研究[42]

3 结论与展望

在EBPR系统运行过程中,不同的运行条件如碳源、温度、SRT、进水P/C等,会影响系统内Accumulibacter进化枝的组成和丰度,目前还难以确定导致不同进化枝富集的决定性因素。Accumulibacter的不同进化枝的代谢特性存在差别,这也为富集不同进化枝提供了可能。

1) Accumulibacter存在多个进化枝,使用碳源的种类不同(例如单一碳源或交替碳源),会富集出不同类型的PAO分枝,乙酸系统既可以富集PAO I,也可富集PAO II,而丙酸更利于PAO I的富集。乙醇作为碳源可以选择性地富集特定分枝的PAO(如PAO IIF)。

2) Accumulibacter不同进化枝的代谢特性及其对不同运行条件的代谢响应存在差别,在分枝水平上,基于ppk1基因定义Accumulibacter各分枝难以明确区分其代谢特性,Accumulibacter各分枝的基因组差异可能导致代谢方式的改变。

3) 对于PAO I-GAO混合种群,反硝化GAO负责进行硝酸盐到亚硝酸盐的部分反硝化,PAO I进而还原亚硝酸盐;反硝化GAO在厌氧阶段与PAO竞争底物,在缺氧环境中为PAO提供电子受体(亚硝酸盐),与PAO既竞争又协作。

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