随着基因工程和蛋白质组学技术的发展，制备多肽和蛋白类药物的成本得到了极大降低^[1]，设计这类药物的给药途径和相应剂型时，考虑更多的是用药的安全性、顺应性和副作用大小。蛋白和多肽类药物注射给药虽疗效确切但顺应性差，因此针对蛋白质和多肽类药物的非注射给药制剂得到了越来越多关注，如口服给药^[2]、肺部给药^[3]、经皮给药^[4]和黏膜给药^[5]等。

虽然胰岛素口服给药的生物利用度远不如注射，但口服给药也有其独特优势，既可以避免长期注射给患者带来的巨大痛苦和不良反应，如身体浮肿、低血糖以及注射部位皮下脂肪萎缩，又能以与内源性胰岛素相同的循环途径从门静脉递送到肝脏，再经肝静脉到达体循环。胰岛素在门静脉和肝脏中蓄积有助于肝脏消化和利用小肠吸收的营养成分，所以胰岛素口服给药不仅较注射更利于控制糖尿病的病情，还能将药物的副作用风险降到最低。但问题是，口服的胰岛素需要穿过胃肠道复杂的环境才能进入体循环，而大多数胰岛素在穿过小肠上皮细胞之前就在肠道内被破坏，只能以没有生物活性的多肽片段进入体循环，这就是为什么胰岛素直接口服后生物利用度还不到2%^[6]。

本论文介绍了药物在肠道内经细胞间和跨细胞吸收的一般机制，对胰岛素口服制剂在肠内的吸收途径进行了分类，并对其经细胞间和跨细胞转运吸收时所遇到的障碍进行了原因分析，最后，对胰岛素口服制剂未来的设计提出了参考建议。

1 影响胰岛素口服吸收的主要因素

胰岛素口服给药生物利用度低，原因有两方面，一是其口服后需要克服胃肠内的多个屏障才能被吸收，其中包括化学屏障(胃肠道的酸碱交替环境)、物理屏障(黏液层和肠上皮细胞)、酶屏障(胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶和胰岛素降解酶等)^[7]，二是蛋白药物的稳定性在制剂加工过程中受到影响^[8]。这些不利因素虽然影响了胰岛素口服吸收的降糖效果，但另一方面也为其口服制剂的开发设计提供了思路：1)增强胰岛素在肠内的渗透作用，加快其吸收；2)通过微囊化包裹或/和加入酶抑制剂使其在胃肠道内免遭破坏；3)在制剂加工时采用温和的温度和pH值环境，并避免使用有机溶剂，最大限度保护其生物活性^[9]。

1.1 物理化学屏障

单层柱状型肠上皮细胞在皮下组织的支撑下在肠腔内形成线性肠上皮层，细胞之间通过紧密连接形成一道物理屏障来阻挡外源性物质进入体循环^[10]。在肠细胞之间形成的紧密连接接头和封闭带是蛋白多肽类亲水性大分子药物的转运通道^[11]。通常情况下，细胞间的紧密连接缝隙不到1 nm，虽然加入一些吸收促进剂或特殊材料如壳聚糖或聚丙烯酸能打开此紧密连接并提高药物的通透性^[12]，但打开后的细胞间隙也还不到20 nm^[13]，正因为如此，粒径大于20 nm的完整纳米粒一般不能借助细胞间途径转运吸收^[14]。肠上皮细胞表面有一层由水、电解质、酶以及蛋白-多糖复合物组成的带负电荷的黏液层，构成一道物理屏障来阻止外源性蛋白向上皮细胞扩散，尤其是弱碱性环境下带负电荷的蛋白质更难在黏液层附着。

胰岛素穿越胃肠道的过程中需要经历从强酸(胃内pH值1.2~3.0)到弱碱环境(肠道pH值6.5~8.0)的变化。如此剧烈的pH值变化容易引起胰岛素氧化、水解或者脱去氨基，从而导致其生物活性受到影响^[15]。

1.2 酶屏障

胃肠道中的酶对胰岛素口服给药的影响最大，从胃腔开始就要面临被胃蛋白酶水解。随后，在肠道中还会面临被胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶和许多未知的酶分解。胰酶只分解外源蛋白质中的20%，剩下的酶解反应则依靠肠绒毛上的膜结合蛋白来完成^[11]。由于胞质中的胰岛素降解酶专门分解胰岛素^[16]，由此断定，游离的胰岛素在肠腔中被肠细胞吸入后也会被酶解而不能进入体循环。更为严重的是，在众多已知和未知的酶当中，1种或2种酶就足以使外源性蛋白质的一级或二级结构发生改变，并因此使其失去自然活性。

1.3 制剂加工过程中胰岛素的稳定性

氨基酸有序排列所形成的多肽链构成了蛋白质的一级结构，多肽链借助氢键和二硫键通过α螺旋和β折叠形成其二级结构，在二级结构基础上，再通过非共价键弯曲折叠形成具有特定构象的球状形态即三级结构^[17]。蛋白质结构的微小变化都会导致其活性丧失，而在制剂加工过程中，有机溶剂、pH值或温度变化都会导致蛋白质的结构变化。在胰岛素制剂加工过程中常采用温和的低温条件如超临界流体低温雾化技术，以保证胰岛素在制备过程中的结构稳定^[18]；此外，还可以依靠双水相中聚合物不同电荷之间形成的聚电解质来制备微球，此法避免了使用有机溶剂并提高了胰岛素的稳定性^[19]。

2 胰岛素在肠道的细胞间转运吸收机制

胰岛素的细胞间转运是指通过肠上皮细胞间隙实现其细胞旁路转运进入体循环。虽然细胞间紧密连接在面积上还不到小肠黏膜表面积的1%，但已经具有非常重要的利用价值^[20]。由于细胞间隙的尺度太小，只有从载体系统中释放出来的游离胰岛素能顺利通过此紧密连接。此外，也是由于胰岛素分子量大且缺乏亲脂性、很难穿过磷脂双分子层来跨越小肠上皮细胞吸收的原因，有关胰岛素口服制剂的研究大都致力于提高其细胞间转运的效果。

2.1 细胞间转运的影响因素

要想实现胰岛素经细胞间转运吸收，需要通过一个载体系统将胰岛素带到特定位点释放并同时打开细胞间的紧密连接，这样才能使胰岛素顺利渗透进入体循环。在这一过程中，胰岛素的转运效果受以下因素影响：a)材料的膜黏附性；b)细胞间紧密连接的开合状态；c)胰岛素在吸收位点的稳定性；d)胰岛素在吸收部位的浓度梯度。

2.2 基于细胞间转运的胰岛素口服制剂设计

根据细胞间转运可能受到的影响因素，对载体系统的设计提出如下几点要求：1)延长胰岛素在肠道内的滞留时间从而为其吸收提供更多机会；2)借助制剂材料来增大细胞间隙以加速胰岛素转运；3)为胰岛素提供一道物理防护层，在释放之前保护其不被破坏；4)在胰岛素释放及肠道转运过程中，抑制胰岛素分解酶的活性；5)加快制剂中的胰岛素在其主要吸收部位释放，依靠浓度梯度来加速其转运。

2.2.1 吸收促进剂的使用

吸收促进剂可以通过改变胃肠道的生理结构来促进药物经细胞间转运，也可以通过其它途径提高药物的跨细胞转运效果，例如：改变肠壁上皮细胞膜的通透性，降低肠壁黏液层的黏度以及打开细胞间的紧密连接，以便让蛋白质药物进入体循环^[21]。在使用吸收促进剂时，需要考虑4个方面的问题：1)吸收促进剂提高药物生物利用度的效果；2)对人体胃肠道环境变化带来的影响；3)对胃肠道渗透性增加所带来的毒副作用；4)不同吸收促进剂的具体作用机制^[22]。

常用的表面活性剂、中链甘油酯、脂肪酸、甾体类洗涤剂、酰基肉碱、烷酰基胆碱、壳聚糖以及其它生物黏附性聚合物等，都可以作为吸收促进剂。Lane等^[23]在混合胶束中使用了胆盐，提高了胰岛素经细胞间吸收时的通透性，并使胰岛素口服后的生物利用度达到了41%。由细胞间途径传递药物虽然会带来一些副作用，但与改变细胞结构的跨细胞转运相比要小得多。但问题是，一旦细胞膜的通透性增加或者细胞间的紧密连接被打开，便会导致所有的多肽和蛋白质向体循环中无差别转运，既有目标药物也有肠道中的异体蛋白，所引起的后果仍需进一步研究。

2.2.2 膜黏附剂的使用

使用膜黏附剂的目的，就是借助其分子间氢键或离子键来黏附于生物膜表面，以增加药物在吸收位点的滞留时间，并通过增加滞留位点的药物浓度梯度来促进其吸收。近年来，超级多孔水凝胶复合材料^[24]、纳米脂质体^[25]、硫醇聚合物^[26]和壳聚糖^[27]都已作为膜黏附剂来应用。在肠道环境中，带正电荷的壳聚糖与黏蛋白上带负电荷的唾液酸基团相互吸引，可以达到膜黏附的效果。此外，还发现壳聚糖能通过调节CLDN4蛋白的表达来可逆性地打开细胞间的紧密连接，提高肠上皮细胞对药物的渗透性^[28]。有一些黏膜黏性附聚合物同时还具有吸收促进剂和蛋白酶抑制剂的功效^[29]。虽然这些膜黏附剂能促进易被酶解的生物大分子药物在肠道内吸收，但其长期生物毒性需要通过大量活体动物实验进行验证。Lin等^[30]利用壳聚糖和聚谷氨酸在pH值6.0的水相中，通过自组装形成了聚电解质复合物并用此辅助胰岛素穿过肠壁细胞间隙，此外，电荷间的相互作用还提高了壳聚糖的膜黏附能力。胰岛素纳米粒以15 IU/kg剂量给药便能使糖尿病大鼠的血糖出现显著下降，当给药剂量达到30 IU/kg，降糖效果更为明显，此时，与皮下注射胰岛素(2.5 IU/kg)相比，虽然降糖的幅度仅约为注射给药的73%，但持续降糖时间超过了10 h，是注射给药的4倍。此外，壳聚糖纳米粒还能穿过黏液层到达肠壁细胞微绒毛。更重要的是，壳聚糖能调节肠壁细胞间紧密连接缝隙的大小，通过其可逆性开合来完成胰岛素的细胞间转运递送。

2.2.3 酶抑制剂的添加

在胃肠道内转运过程中，对胰岛素最大的破坏来自于肠道内的蛋白多肽酶，它们包括胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶等^[31]，除此之外，小肠中还有许多未知的蛋白酶也会分解胰岛素。在载有蛋白质药物的给药系统中加入酶抑制剂，通过克服酶屏障会在一定程度上更多地保留药物的活性。

Yamamoto等^[32]考察了5种不同的酶抑制剂对肠道中胰岛素的保护作用，然而，仅在胃肠道的大肠部位显示出提高了胰岛素的生物有效性。例如，在大肠部位使用酶抑制剂Camostat后，胰岛素生物利用度提高的幅度为5.1%，而在胰岛素的主要吸收部位小肠使用，却只有0.1%。原因是，在肠壁黏膜上有许多未知的蛋白酶，其活性无法被特定的酶抑制剂抑制。其他学者也证明了不同酶抑制剂只能在肠道内的特定部位发挥作用，这从另外一方面说明：如果能找到一种广谱性酶抑制剂就可以彻底解决蛋白多肽类药物在肠道内递送和滞留时的稳定性问题。

然而，酶抑制剂的使用本身也存在许多问题，例如，那些在肠道内通过分解蛋白来维持或改变肠道环境的酶，其活性也会受到酶抑制剂的抑制，而这些有益酶的活性受到抑制后会带来什么样的毒副作用，仍然需要通过长期毒理学实验进行确认。

胰岛素穿过细胞间隙实现被动转运吸收时，首先需要胰岛素从载体中快速释放出来，然而此时的游离胰岛素在由细胞间隙进入体循环之前会遇到大量的蛋白酶。为了防止释放出来的胰岛素被蛋白酶破坏，有效的办法就是加入广谱、速效且对蛋白酶的活性产生可逆性抑制的酶抑制剂，这种酶抑制剂能在胃肠道的各个部位抑制蛋白酶的活性，寻找这样的酶抑制剂将是开发多肽/蛋白质药物口服制剂的研究方向。李益等^[33]在包载胰岛素的缓释微球中建立了一个由弱酸性材料构成的缓释缓冲体系，依靠这种弱酸性微环境来可逆性地抑制胰蛋白酶的活性。胰蛋白酶只能在pH值7.6~8.5的弱碱性环境下发挥最大功效，当其周围环境从pH值7.6降低到pH值4.3时，其活性也相应地降低了130倍。蛋白酶的活性降低减弱了其对胰岛素的破坏，相应地提高了胰岛素的吸收。对糖尿病模型大鼠进行的降糖实验表明，灌服含有弱酸性微环境缓冲体系的胰岛素微球后，大鼠的血糖值在2~4 h内显著下降，与对照组相比，实验组的血糖降低幅度超过了35%。

3 胰岛素在肠道的细胞内转运吸收机制

现有的纳米粒虽然很难通过细胞间传递途径进入体循环，但可以通过主动转运实现跨细胞递送。已知的主动运输途径有4条，分别是：以M细胞为主体的胞噬作用、网格蛋白介导的胞吞作用、大胞饮和凹蛋白介导的胞吞作用^[34]。跨细胞转运药物的载体有纳米粒、脂质体和水凝胶等。

3.1 细胞内转运的影响因素

理想的胰岛素载体不仅能避免胰岛素在肠道内暴露，还能保护胰岛素在胃肠道内免受pH值变化的影响以及不被蛋白酶降解。因此，载有胰岛素的载体应于药物释放前在小肠内以完整粒子形式被快速吸收。载体粒子的大小、电荷以及聚集趋势都会影响其穿越肠壁吸收的速率和效果。即便是细胞间的紧密连接完全打开时，粒径超过150 nm的颗粒也不能完整地通过Caco-2单细胞层^[35]。但研究发现，M细胞却能选择性地吸收粒径在150~400 nm的微粒^[36]。此外，纳米粒中的某些成分能和细胞膜表面的关键基团可逆性地形成复合物，并由此转运进入细胞，复合物在细胞中解离后又与另一侧基底双分子层形成新的复合物，并立即离开细胞进入体循环^[36]。药物载体穿越细胞递送药物时需要穿过肠壁细胞的磷脂双分子层，此时，载体系统与肠壁细胞膜会在分子间产生相互作用。因此，细胞内转运药物的效果会受到以下3种因素的制约：1)载体的粒径大小；2)载体材料的膜黏附性；3)与载体相连接的配体种类与数量。

3.2 基于细胞内转运的胰岛素口服制剂设计

基于细胞内转运的胰岛素口服制剂设计时，选择合适的聚合物载体尤为重要。聚合物微粒的粒径大小、表面电荷和膜黏附性都会影响其跨膜转运。研究表明，10 μm以下的病原菌和微粒都能被肠道内的淋巴小结吸收^[37]，其中包括Peyer’s结、阑尾和一些隐藏的淋巴结；50~500 nm的微粒具有良好的跨细胞转运效果，其中，50~100 nm的微粒直接经肠上皮细胞吸收，再大一点的被M细胞吸收^[38]。表面电荷和膜黏附性决定着载体粒子在肠壁上的滞留时间，因此也影响其吸收效果。

配体的种类和数量在药物的细胞内转运过程中也非常重要，在微粒表面通过共价键连接特定蛋白或维他命作为配体，也能有效地促进微粒载体的跨细胞吸收^[39]。因此，选择合适的聚合物载体、改变纳米粒的物理化学性质，或者在颗粒表面引入特殊基团来增强胞吞作用，都能起到增强药物跨细胞转运的效果。

用凝聚素修饰的胰岛素固体脂质纳米粒，口服后的相对生物利用度能达到皮下注射的7.11%^[40]。维他命B₁₂(VB₁₂)能与小肠内的内生因子(IF)结合形成VB₁₂-IF复合物，这种复合物又能被肠壁细胞表面受体所识别，从而促进链接有VB₁₂的载体转运穿过肠细胞^[41]。Zhang等^[42]制备了生物素化的胰岛素纳米脂质体，并把与生物素共轭的磷脂整合到脂质体膜表面，借此实现了脂质体的生物素化。生物素化脂质体能通过受体介导的胞吞作用实现胰岛素的高效吸收，因此达到了8.23%的绝对生物利用度。胰岛素被连接到转铁蛋白分子上以后，能借助受体介导的跨细胞胞吞途径被肠上皮细胞吸收，此外，用水凝胶作载体也能提高胰岛素的稳定性和生物利用度^[43]。近期的研究表明，细胞穿膜肽可以作为新型配体用于胰岛素的细胞内转运，在和亲水性载体配合后制备的纳米粒能将胰岛素在肠上皮黏液分泌细胞上的转运效率较胰岛素溶液提高20倍^[44]。

虽然使用特殊的靶向载体带来了一些令人振奋的结果，但由于大部分载体颗粒难以被肠细胞直接吸收，而配基修饰的聚合物是否能被肠上皮细胞和Peyer’s结中的M细胞很好吸收，迄今还存在争议；此外，M细胞长期吸收聚合物载体所引起的机体免疫反应以及由此带来的细胞毒性也不容忽视；此外，受体介导的胰岛素载体粒子借助内吞作用进入生物体的数量也还偏少，配体与载体结合的数量和可重复性也偏低，难以进行后续优化实验。

4 胰岛素口服制剂的前景展望

自1921年胰岛素被发现并随后在临床上得到应用，至今已经过去了将近1个世纪，虽然迄今为止还没有一个成熟的口服胰岛素制剂产品上市，但所取得的基础性研究进展，特别是克服胰岛素在胃肠道的化学屏障、物理屏障、酶屏障以及增强胰岛素自身稳定性问题上所取得的成果，已经足以令人看到口服胰岛素未来的光明前景。当我们从药物的细胞间和跨细胞转运的普遍机制出发，沿着口服胰岛素的研究历程进行历史回顾和前景展望时，感觉以下几点对进一步提高口服胰岛素的生物利用度具有一定的参考价值。1)在学科交叉领域寻找更新的纳米载体制备技术，使胰岛素载体的粒径小于20 nm，以便能顺利地通过细胞间隙进入体循环；2)利用复合制剂技术，例如将载有胰岛素的微球进行肠溶包衣，或直接装入肠溶胶囊中，使胰岛素彻底避免胃腔环境的破坏；此外，通过速释制剂技术使载体中的胰岛素在肠壁细胞周围迅速释放，依靠较高的浓度梯度来加速药物向细胞内扩散吸收；3)无论是胰岛素的细胞间转运还是跨细胞转运，其前提条件都需要胰岛素有足够的稳定性，要达到这一点，一个重要工作就是开发高效、无毒的新型蛋白酶抑制剂，并将此用于口服胰岛素的给药系统中。