2017, Vol. 34
大多数有机化合物晶体形成过程中存在多晶型现象，即其固体状态存在2种或2种以上的不同分子排列方式，从而形成多种不同形态和功能的晶体。现有原料药半数以上的品种存在着多晶型现象。不同的药物晶型之间存在明显不同的物化性质，如溶解度，稳定性，生物利用度等[1-3]。因此，研究影响有机晶体多晶型调控的规律对于医药、燃料和农药等行业具有重要意义。
传统调节药物结晶过程的因素主要包括：溶剂、过饱和度、温度、pH值、降温速率等。近来，利用添加剂调节有机分子结晶过程的报道不断涌现。例如，Deoliveira等[4]发现不同构象的生物大分子多肽对碳酸钙晶体生长产生了显著的影响，由于多肽与晶体特定表面具有识别作用而导致不同晶型的生成。He等[5]在4-甲基-2-硝基乙酰苯胺的结晶过程中加入了2种同构类似物作为添加剂，导致了不同多晶型的产生。Wei等[6]在L-谷氨酸结晶过程中加入了多种氨基酸作为添加剂，研究发现L-色氨酸和L-组氨酸能够促进α-晶型的生成、抑制其它晶型的产生。
茶碱(theophylline，简称TP)是一种治疗哮喘的支气管扩张剂，具有放松支气管的平滑肌，松弛兴奋中枢神经，加强心肌收缩，扩张冠状动脉等作用，分子结构如图 1a)所示。目前已报道的茶碱有4种无水晶型(Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ)和1种水合晶型(M)。Ⅳ晶型是被认为最稳定的晶型，可以用过量的茶碱在甲醇中浆化得到[7]。
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| 图 1 茶碱、腺嘌呤核苷和胸腺嘧啶核苷分子结构 Figure 1 Molecular structure of theophylline, adenosine and thymidine |
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寡聚核苷酸是由低于20个碱基组成的短链DNA生物大分子，其碱基包括：腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)。碱基上富含的N、O可以作为氢键的供体或者受体，DNA的碱基与碱基之间可以通过特定的氢键互补配对[8-9]。图 1b)所示为腺嘌呤核苷的分子结构，与茶碱结构具有相似性。前期文献已表明，不同碱基组成的寡聚核苷酸能显著调节钯亚纳米团簇的聚集形态与催化特性[10]、银纳米粒子不同晶面的生长速率[11]，因此，本研究分别选取腺嘌呤、胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸为添加剂，研究了该添加剂对茶碱多晶型的影响作用。
1 实验材料和方法 1.1 实验材料茶碱(TP)，天津希恩思生化科技有限公司提供，质量分数大于98%，其PXRD出峰位置为7.2°、12.7°和14.9°，与文献对比鉴定为Ⅱ晶型。化学纯乙醇(Ethanol)购自天津江天化工有限公司；实验用水为实验室自制三蒸水。寡聚核苷酸序列d(A10)、d(A20)、d(T20)为大连宝生物(Takara)公司合成，相对分子质量分别为3070.1、6202.2、6022.0。经液相色谱分析，寡聚核苷酸的质量分数大于99%。
1.2 结晶实验与表征寡聚核苷酸溶液预处理：室温下将样品溶解于三蒸水中，经过95 ℃退火后用紫外光谱测定吸光度标定溶液中寡聚核苷酸的浓度，4 ℃保存备用。
茶碱过饱和溶液配置：室温下将茶碱溶于乙醇-水(体积比为2:1) 中，配置过饱和度为3.5的溶液。过饱和度的计算式为：
结晶过程：在结晶器中定量加入的寡聚核苷酸水溶液，摇动混匀，50 ℃保温20 min，以0.5 ℃·min-1的降温速率降温到4 ℃结晶。采用真空抽滤收集晶体，真空常温干燥12 h后进一步表征。
采用圆二色光谱(CD，Jasco J-810) 检测溶液中寡聚核苷酸与茶碱分子之间的相互作用。晶体样品分别用偏光显微镜(XY-P系列)、粉末X-射线衍射(PXRD，Rigaku D/max 2500)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR，Thermo Nicolet IZ10) 和拉曼光谱(Raman，RENISHAW)进行表征。
1.3 分子模拟茶碱晶体结构是从剑桥晶体数据库(Cambridge Crystal Database)中得到。在Material Studio软件中建立晶体多晶型模型，采用Morphology模块，分别用BFDH模型和AE模型进行晶习预测，得到重要生长晶面。
将寡聚核苷酸作为吸附质，用Adsorption Locater模块吸附到晶面分子层上，设定力场为cvff[12]，精度设为fine。从生成的20个构型中选取较为合理的3个，然后用Forcite模块的几何优化得到能量最低的状态。茶碱晶面与添加剂之间的相互作用能计算式为：
| $ {E_{{\rm{interaction}}}} = {E_{{\rm{total}}}} - {E_{{\rm{crystal}}}} - {E_{{\rm{additive}}}} $ | (1) |
式(1) 中，Einteraction即晶体与添加剂之间相互作用能，Etotal是晶体与添加剂结合并优化后得到的总能量，Ecrystal是晶体单独存在时的能量，Eadditive是添加剂单独存在的能量。当相互作用能为负值时，说明两者倾向于结合，绝对值越大，结合越稳定；当相互作用能为正值时，说明两者倾向于排斥，绝对值越大，斥力越大。
寡聚核苷酸分子结构是从蛋白数据库(PDB)中，选取DNA序列(Model PDB ID：4HW1) 得到。由于计算集群运算能力的局限，选取连续的3个碱基片段AAA进行分子模拟计算。首先用Dmol3模块进行结构优化，交换相关能量函数选用GGA-Pw91，DNP基组，使用水溶剂环境，自旋限制，集合优化中所有原子都处于松弛状态。收敛判别准则为：能量E=0.26255 kJ/mol，梯度Grad=5.251 kJ/mol/Å-1，笛卡尔坐标Coord=1.0×10-4 Å(1 Å=0.1 nm)。
2 实验结果与讨论 2.1 茶碱对寡聚核苷酸分子构象的影响溶液中寡聚核苷酸分子通过自组装会形成特定的构象，实验中采用圆二色光谱表征了溶液中茶碱对寡聚核苷酸分子构象的影响。图 2所示为茶碱-A20混合溶液在室温下的圆二色谱法图，其中A20的浓度为20 μmol/L。
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| 图 2 茶碱-A20溶液的圆二色谱法图(25 ℃)，A20浓度：20 μmol/L，茶碱浓度：0~4 mmol/L (TB/base为茶碱与碱基的比值) Figure 2 CD spectra of the TP-A20 solutions(25 ℃), the concentration of A20 is 20 μmol/L, the concentration of TP is 0~ 4 mmol/L (TB/base is the radio of theophylline and base) |
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从图 2中可以看到，随着茶碱浓度的增加，A20在220 nm处的特征正峰明显下降，且出现了明显的红移，说明A20的二级结构发生明显变化；当茶碱与碱基比大于2时，在265~270 nm之间出现新的负峰，说明茶碱与A20之间存在较强的相互作用。寡聚核苷酸A10与A20相比，其组成的碱基都是腺嘌呤只是个数减少为10个，茶碱-d(A10)溶液的圆二色谱法图与图 2类似，表明茶碱与A10之间也存在一定的相互作用。而寡聚核苷酸d(T20)的碱基组成为胸腺嘧啶，茶碱-d(T20)溶液的圆二色谱法图的特征峰强度随着茶碱浓度的增加而下降，但没有新的特征峰形成，说明茶碱与T20之间的作用力相对较弱。
2.2 寡聚核苷酸对茶碱晶型的影响图 3和图 4分别是不同寡聚核苷酸添加剂作用下、降温速率为0.5 ℃·min-1时得到的茶碱晶体的偏光照片和PXRD谱图。
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| 图 3 茶碱晶体的偏光照片(放大50倍) Figure 3 Photomicrographs of theophylline crystals |
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| 图 4 不同添加剂作用下的茶碱晶体XRD谱图 Figure 4 XRD patterns of theophylline in the presence of different additives |
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由图 3可知，没有添加剂存在时，结晶样品的形貌特征是针状，晶型包括Ⅱ晶型和M晶型。在存在d(T20)浓度为1 mg/L时，获得的结晶样品为细小的针状，晶型则与无添加剂的情况相近，也包括Ⅱ晶型和M晶型。当分别添加浓度为2 mg/L的d(A10)和浓度为2 mg/L的d(A20)时，结晶样品呈现棒状、晶型只有M晶型，这表明添加d(A10)或d(A20)能显著影响茶碱结晶过程的分子间作用力。考虑到寡聚核苷酸d(A10)、d(A20)相对分子质量较大，为了揭示其对茶碱结晶过程的影响，我们采用分子模拟的方法研究了茶碱多晶型不同晶面与3个腺嘌呤碱基组成的核苷酸片段(AAA)的相互作用。
2.3 寡聚核苷酸与茶碱不同晶面的相互作用分别采用BFDH方法和AE方法预测了茶碱的晶习，与实验观测的晶习对比说明用AE方法预测得到的茶碱晶习实验观测形貌基本一致，根据AE方法预测的晶习确定了茶碱多晶型的重要生长晶面，如表 1所示。进一步采用分子模拟的方法计算了上述重要晶面与腺嘌呤核苷酸片段AAA的相互作用能。
| 晶型 | 晶面Miller指数(h k l) |
| Form Ⅰ | (011)(020)(110)(111)(120)(210)(201) |
| Form Ⅱ | (100)(001)(010)(101)(110)(111)(201) |
| Form Ⅳ | (002)(011)(100)(11-1)(111)(11-2) |
| Form M | (002)(011)(020)(10-1)(11-1)(110)(120) |
图 5所示为分子模拟计算的AAA片段与茶碱多晶型的重要生长晶面之间的相互作用能。
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| 图 5 茶碱重要晶面与AAA片段之间的相互作用能 Figure 5 The interaction energies between AAA segment and important faces of theophylline polymorphs |
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由图 5可知，AAA片段与茶碱Ⅰ晶型、Ⅱ晶型和Ⅳ晶型表面平均相互作用能分别为-282.8、-287.5和-274.5 kJ·mol-1；而与M晶型表面平均相互作用能为-376.2 kJ·mol-1。这说明AAA在M晶型表面吸附能力最强，因此，在茶碱结晶过程中AAA会优先促进M晶型的生长。
3 结论1) 采用以腺嘌呤核苷组成的寡聚核苷酸d(A10)、d(A20)为添加剂，能够显著影响乙醇-水体系降温结晶过程中茶碱多晶型的形成，促进M晶型生成；而胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸d(T10)则基本不影响茶碱多晶型的形成。
2) 分子模拟研究揭示了腺嘌呤碱基组成的核苷酸片段与茶碱M晶型重要晶面之间的相互作用能最强，正是这种强相互作用促进了茶碱结晶过程中M晶型的生长。
| [1] |
龚俊波, 王琦, 董伟兵, 等. 药物晶型转化与控制的研究进展[J].
化工学报, 2013, 64(2): 385–392.
Gong Junbo, Wang Qi, Dong Weibing, et al. Progress on transformation and manipulation of drug polymorphism[J]. CIESC Journal, 2013, 64(2): 385–392. |
| [2] | Brittain H G. Polymorphism and solvatomorphism 2010[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2012, 101(2): 464–484. DOI: 10.1002/jps.22788 |
| [3] |
周肖寅, 刘峥, 冯小珍. 药物多晶型现象研究进展[J].
化学与生物工程, 2010, 27(10): 1–5.
Zhou Xiaoyin, Liu Zheng, Feng Xiaozhen. Research advance of drug polymorphism[J]. Chemistry & Bioengineering, 2010, 27(10): 1–5. DOI: 10.3969/j.issn.1672-5425.2010.10.001 |
| [4] | Deoliveira D B, Laursen R A. Control of calcite crystal morphology by a peptide designed to bind to a specific surface[J]. Journal of the American Chemical Society, 1997, 119(44): 10627–10631. DOI: 10.1021/ja972270w |
| [5] | He X, Stowell J G, Morris K R, et al. Stabilization of a metastable polymorph of 4-methyl-2-nitroacetanilide by isomorphic additives[J]. Crystal Growth & Design, 2001, 1(4): 305–312. |
| [6] | Mo Y, Dang L, Wei H. L-glutamic acid polymorph control using amino acid additives[J]. Industrial & Engineering Chemistry Research, 2011, 50(18): 10385–10392. |
| [7] | Seton L, Khamar D, Bradshaw I J, et al. Solid state forms of theophylline: Presenting a new anhydrous polymorph[J]. Crystal Growth & Design, 2010, 10(9): 3879–3886. |
| [8] | Fu Y, Wang X, Zhang J, et al. Orderly microaggregates of G-/C-rich oligonucleotides associated with spermine[J]. Biomacromolecules, 2011, 12(3): 747–756. DOI: 10.1021/bm101372h |
| [9] | Fu Y, Wang X, Zhang J, et al. Nanomaterials and nanoclusters based on DNA modulation[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2014, 28: 33–38. DOI: 10.1016/j.copbio.2013.10.014 |
| [10] | Zhang J, Wang X, Fu Y, et al. Highly active subnano palladium clusters embedded in i-Motif DNA[J]. Langmuir, 2013, 29(47): 14345–14350. DOI: 10.1021/la402153b |
| [11] | Wu J, Tan L, Hwang K, et al. DNA sequence-dependent morphological evolution of silver nanoparticles and their optical and hybridization properties[J]. Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(43): 15195–15202. DOI: 10.1021/ja506150s |
| [12] | Zhang J, Wu Y, Liu A, et al. Mechanistic insight into the selective crystallization of the metastable polymorph of tolbutamide in ethanol-water solution[J]. RSC Advances, 2014, 4: 21599–21607. DOI: 10.1039/C4RA01705F |