海藻酸盐是一种天然的高分子多糖，以海藻酸钠为原料制备的多孔海绵可使伤口处在一个温暖而湿润的愈合环境中，促进伤口的愈合^[1-2]，因此海藻酸基敷料的研究引起了广泛关注。冻干法是制备海藻酸基海绵最常用的方法之一^[2-4]，近期Andersen等采用机械搅拌发泡制孔，结合内源凝胶法，制备了多孔海藻酸钙海绵，无需冻干，制备简便快速^[5-6]。

此外为了增加抗菌性，载银敷料的研制也是热点研究问题。目前在海藻酸基材料上载银常见的方法有：喷涂浸渍法^[7]、离子交换法^[8]、在位还原法^[9-11]和共混纺丝法^[12]等。常规的在位还原法是将海藻酸钙海绵浸渍AgNO₃溶液后，再用NaBH₄^[13]等还原剂还原以获得载纳米银的海藻酸基敷料。

本研究采用Andersen等的方法制备了海藻酸钙海绵，并对其干燥与后处理过程进行了改进，使得海绵的并泡和体积收缩程度大大降低，考察了后处理实验条件对海绵的吸液率、保液率以及力学性能的影响。此外采用了一种更为简便的在位还原法，利用甘油的还原性及增塑性，制备出了载有纳米银且柔韧性良好的海藻酸钙海绵。通过采用抑菌圈方法，考察了载银海绵对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性。

1 实验部分 1.1 实验材料

海藻酸钠(ALG-Na)，青岛黄海制药有限公司，医药级；其它试剂，天津市光复科技发展有限公司，分析纯。

1.2 海藻酸钙海绵及载银海藻酸钙海锦的制备

将一定量CaCO₃、吐温20与ALG-Na溶液混合均匀得到混悬液，混悬液中海藻酸钠质量分数为2%，将混悬液搅拌发泡20 min，加入一定量葡萄糖酸内酯(GDL)，搅拌均匀后注入模具中，凝胶90 min后，得到发泡湿凝胶。发泡湿凝胶浸渍在无水乙醇中处理30 min后，置于干燥箱中80 ℃烘干，得到厚度4 mm的海藻酸钙硬海绵，然后用不同浓度乙醇-甘油水溶液对其浸泡处理6 h，再次置于烘箱中80 ℃烘干即得具有一定柔韧度的海藻酸钙海绵。

将上述制备的海藻酸钙硬海绵用不同浓度的AgNO₃溶液浸渍3 h，然后用不同浓度乙醇-甘油水溶液浸泡处理6 h，置于烘箱中80 ℃烘干即得载纳米银海藻酸钙海绵。

1.3 结构表征与性能测试

海绵形貌观测：将海绵裁剪成方形尺寸并拍照，观察海绵的表面形貌；将海绵断面喷金，采用日本日立公司的S-4800型场发射扫描电子显微镜(SEM)观察海绵的断面形貌；将载银海绵在无水乙醇中超声30 min，将超声后液体滴在微栅上，采用JEM-2100型场发射透射电镜(TEM)进行观测，操作电压为200 kV，图像经过CCD拍照记录。

吸液率、保液率与力学性能测试：将海绵裁剪成3 cm×3 cm尺寸，称其初始质量W，浸于蒸馏水或生理盐水24 h后取出，用滤纸迅速吸去表面水分，称其湿质量W₁，吸液率=(W₁-W)/W，g/g；将上述吸液率测试后的样品放入离心管中，经5 000 r/min离心10 min后，称其质量为W₂，保液率=(W₂-W)/W，g/g；将干燥的海绵裁剪成标准样条，在WD-1型万能材料试验机上对其进行力学性能测试。

海绵抑菌实验：以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为试验细菌，在37 ℃下培养24 h后，以海藻酸钙海绵为空白对照，采用抑菌圈法测试载银海藻酸钙海绵的抑菌性能。

2 结果与讨论 2.1 海绵形貌观测

Andersen等以CaCO₃为凝胶剂，GDL为酸化剂，甘油为增塑剂，采用机械搅拌制孔制备了多孔海藻酸钙海绵^[5]。但我们在实际操作过程中发现，将甘油预先添加到湿凝胶中，湿凝胶在80 ℃环境下干燥时，海绵并泡现象严重，体积会发生较大皱缩。这主要是因为甘油有很强的吸湿性，干燥过程中会大大降低水分子的迁移速率，导致海绵内的海藻酸钙气壁长期处于溶胀状态，强度低，易于产生并泡现象，甚至海绵中间形成1个较大的气囊；此外对于制备具有一定厚度的海绵，可能导致海绵长时间不能完全干燥。

因此本研究在制备湿凝胶过程中不添加甘油，采用乙醇处理湿凝胶后再干燥，一方面海藻酸钙气壁在有机溶剂作用下，强度明显提高，另一方面乙醇的存在有利于加速干燥过程，最终获得孔洞丰富且具有一定厚度的海藻酸钙硬海绵。此时的海绵质硬而脆，为增加海绵的柔韧性并防止海绵因过度水化而发生并泡现象，我们进一步采用乙醇-甘油水溶液对海绵进行处理，获得了具有一定柔韧性的海藻酸钙软海绵。外观形貌见图 1，截面SEM图见图 2。

由图 1a)可见，经乙醇-甘油水溶液处理后，海藻酸钙海绵具有优良的柔韧性和弹性，可任意弯折，经按压后能够弹起恢复原貌，其外观颜色如图 1b)所示为白色。从图 2可见海绵内部的孔呈不规则的多面体形态，孔壁上有孔洞可相互联通，孔径在200~500 μm之间。

本研究采用的海绵载银方法为在位还原法，海藻酸钙海绵经AgNO₃溶液浸渍后，然后用乙醇-甘油的混合溶液处理并高温干燥，得到了载有纳米银的海藻酸钙海绵。如图 1c)和图 1d)所示海绵颜色为黄褐色与棕褐色，与文献报道一致^[10]。AgNO₃溶液浓度越大，沉积出的纳米银含量越高，海绵颜色越深。表明将海藻酸钙海绵浸入AgNO₃溶液后，通过海藻酸钙对Ag⁺的吸附将Ag⁺均匀地分散在海绵上，高温干燥过程中，通过海藻酸和甘油的还原作用，Ag⁺被还原成Ag⁰沉积在海绵上。研究表明，以硝酸银或氧化银为前驱体，利用海藻酸钠^[14-15]和甘油^[16]的羟基对Ag⁺进行还原反应，可获得纳米银颗粒。但甘油还原Ag⁺的反应比较复杂，所涉及的主要反应如式(1)~(3) 所示^[16]。

$ {{\text{C}}_{\text{3}}}{{\text{H}}_{\text{8}}}{{\text{O}}_{\text{3}}}{\text{+2A}}{{\text{g}}^{\text{+}}}{\text{+2O}}{{\text{H}}^{\text{-}}}{\text{=}}{{\text{C}}_{\text{3}}}{{\text{H}}_{\text{6}}}{{\text{O}}_{\text{3}}}{\text{+2Ag+2}}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{O}} $

(1)

$ {{\text{C}}_{\text{3}}}{{\text{H}}_{\text{8}}}{{\text{O}}_{\text{3}}}{\text{+4A}}{{\text{g}}^{{\text{+}}}}{\text{+4O}}{{\text{H}}^{{\text{-}}}}{\text{=}}{{\text{C}}_{\text{3}}}{{\text{H}}_{\text{6}}}{{\text{O}}_{\text{4}}}{\text{+4Ag+3}}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{O}} $

(2)

$ {{\text{C}}_{\text{3}}}{{\text{H}}_{\text{8}}}{{\text{O}}_{\text{3}}}{\text{+6A}}{{\text{g}}^{{\text{+}}}}{\text{+6O}}{{\text{H}}^{{\text{-}}}}{\text{=}}{{\text{C}}_{\text{3}}}{{\text{H}}_{\text{4}}}{{\text{O}}_{\text{4}}}{\text{+6Ag+5}}{{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{O}} $

(3)

本研究的海藻酸基海绵载纳米银方法，可直接在海藻酸钙凝胶上沉积纳米银离子，简便有效，同时避免了外加其它还原剂在海绵中的残留。

2.2 纳米颗粒的TEM观测

图 3为载银海藻酸钙海绵在无水乙醇中超声后纳米银的TEM图。

从图 3a)可见，纳米银颗粒的出现表明本研究采用的载银方法可有效在海绵上负载纳米银颗粒。由图 3b)可见，纳米银的粒径主要分布在25~45 nm之间。采用NaBH₄为还原剂制备的载银海藻酸膜^[13]与电化学方法制备的载银微球^[17]，其纳米银颗粒大小分别15~20与10~30 nm，相比之下，本研究海藻酸基海绵负载纳米银颗粒略大。

2.3 海藻酸钙海绵的表观密度

如表 1给出了海藻酸钙海绵的表观密度。

由表 1可见海藻酸钙硬海绵的表观密度较低，已经达到了气凝胶的表观密度。海藻酸钙硬海绵在乙醇-甘油水溶液中处理后，表明观密度明显上升，这主要与海绵的含水量增加有关。甘油浓度越大，海绵的表观密度越大，这主要由于甘油具有良好的保湿性，可增加海绵的含水量。而乙醇的存在可提高水分蒸发的速度，因此乙醇浓度越大，海绵的含水量越低。采用50%乙醇-6%甘油的水溶液处理的海绵表观密度相对较低。

2.4 ALG-Ca海绵的吸液性能和保液性能

理想的伤口敷料应当具有优异的吸液性能和保液性能，从而可以吸收大量的伤口渗出液。表 2给出了乙醇-甘油水溶液浓度对海藻酸钙海绵的吸液率和保液率的影响。

从表 2可见，甘油含量的增加使得海绵的吸液率和保液率有所降低，而随乙醇含量的增加吸液率和保液率有所提高，同时海绵在蒸馏水中的吸液率和保液率都高于在生理盐水中的吸液率和保液率。采用50%乙醇-6%甘油处理的海绵具有相对较高的吸液率和保液率。

由表 1可知，干燥后海绵中的含水量会随着甘油含量的升高而提高，使得海绵在吸水达到饱和时，能够吸收的外界水分减少，导致海绵的吸液率降低，由于甘油含量的升高会引起海绵干质量的增加，所以将吸液平衡海绵离心后，海绵的保液率也降低。此外，海绵干质量会随着乙醇含量的升高而减小，所以在吸水达到饱和时，海绵可以吸收更多的水分，致使吸液率升高，进一步离心后，保液率也会因海绵干质量的降低而升高。另外，海绵在生理盐水中将承受一定的渗透压，使得海绵对生理盐水的吸收相对较低，且生理盐水中的Na⁺与海绵中的Ca²⁺发生离子交换，浸泡一段时间后，海绵的表面和孔壁会变得酥软，弹性降低，海绵的体积膨胀率以及离心后海绵中保存的水分随之减少，因此，海绵在生理盐水中的吸液率和保液率比在蒸馏水中的相对较低。

研究表明^[4]通过冻干法制备的海藻酸浓度为2%时的海藻酸钙海绵对蒸馏水和生理盐水的吸液率分别约为9.8和10.7 g/g；保液率分别约为0.85和1.15 g/g，相比之下，本研究制备的海藻酸钙海绵的吸液率及保液率相对较高。

2.5 ALG-Ca海绵的力学性能

表 3给出了乙醇-甘油水溶液浓度对海藻酸钙海绵力学性能的影响。

由表 3可见，随甘油含量的增加，将会使得海绵的拉伸强度降低、断裂伸长率提高，而乙醇对海藻酸钙海绵力学性能的影响相反，即乙醇含量提高，海绵的拉伸强度增加、断裂伸长率降低。采用50%乙醇-6%甘油处理的海绵具有相对较高的拉伸强度而断裂伸长率较低。

这是因为甘油是多羟基小分子增塑剂，与海藻酸钙大分子中的羟基和羧基相互作用形成氢键，从而削弱了海藻酸钙分子内部及分子间作用力，致使海绵的拉伸强度下降，同时由于海藻酸钙分子间作用力的削弱，使得海藻酸钙分子的自由度得到提高，增加了海绵在外力作用下的延展性，因此海绵的断裂伸长率增加。而海藻酸钙在乙醇的作用下，高分子链分子间作用力增强，同时海藻酸分子的自由度降低，从而使得海绵的拉伸强度增加，断裂伸长率降低。

文献[3]对冻干海藻酸钙海绵(采用2%海藻酸钠制备，90%乙醇-3%甘油后处理)进行了力学性能测试，海绵的拉伸强度为0.21 MPa，断裂伸长率6.93%，相比之下，本研究制备的海藻酸钙海绵，拉伸强度略低，但断裂伸长率明显提高，即柔韧性相对较好，这与本研究使用的甘油浓度较高有关。

2.6 ALG-Ca海绵载银后的抑菌性能

图 4给出了抑菌圈实验结果照片。每个培养皿上端白色海绵为海藻酸钙海绵，作为空白对照，下面2个有色海绵为载纳米银海藻酸钙海绵的2个平行样品。抑菌圈大小见图 5。

由图 4和图 5可见，海绵负载纳米银后均产生了明显的抑菌圈，表明纳米银对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌性能。当AgNO₃溶液浓度为37.5×10^-6与75×10^-6时，海绵的颜色较浅，表明沉积的纳米银量还较少，抑菌圈大小变化不大，当AgNO₃溶液浓度为125×10^-6时，海绵的颜色较深，沉积的纳米银含量明显增加，此时的抑菌圈直径也显著提高，表明纳米银含量越高抑菌能力也越强。

比较图 5中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小，可见纳米银对大肠杆菌抑菌效果相对较好，与文献[18]通过γ射线照射制备的载有纳米银的聚乙烯醇/海藻酸膜对2种细菌的抑菌性能的报道一致，这可能是因为2种细菌的细胞壁结构不同导致与纳米银的结合能力不同，从而抑菌效果不同。

3 结论

1) 采用乙醇处理湿凝胶可加速干燥过程，保留海绵孔道结构；采用乙醇-甘油水溶液后处理，可获得具有一定柔韧性的海藻酸钙海绵。

2) 海藻酸钙海绵经AgNO₃溶液浸渍后，用乙醇-甘油水溶液后处理并高温干燥，可得到载纳米银海藻酸钙海绵，其中甘油既增加了海绵的柔韧性，又可作为还原剂促进纳米银颗粒的生成。

3) 乙醇-甘油水溶液中甘油含量越低，乙醇含量越高，海绵的吸液率和保液率也越高，此时的拉伸强度也相对较高，但断裂伸长率较低。

4) 载纳米银海藻酸钙海绵对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均具有良好的抑菌性能。